非特异性杂交反应(荧光原位杂交)

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单克隆抗体通常被认为具有特异性。但是有趣的是。有不少研究报道。单克隆抗体重链和轻链基因在杂交瘤中存在着多样性。由于这种普遍的多样性还未报道过。本文集中分析了185种随机选择的杂交瘤。杂交瘤的选择并没有偏好于难克隆和已知有额外表达链。在185种杂交瘤中。有126种杂交瘤。占总数的68.1%不含额外的链翻译产物。然而仍有59种。占总数31.9的杂交瘤含有多与1种重链或轻链的表达。这些额外链基因的表达降低了目标抗体的特性。包括特异性。结合信号以及信噪比。这些影响在酶联免疫。免疫组化实验中都有很好的体现。杂交瘤中大量的丰富的mRNA转录本并不一定提供正确的特异性抗体表达。因此。在克隆抗体基因时。需要对所有可能的VH和VL组合进行功能验证。以识别那些具有最高亲和力和最低交叉反应活性的组合。这些发现反映了杂交瘤研究的现状。重申了序列重组抗体用于研究或诊断的重要性。

引言

尽管近些年来大家对单克隆抗体的特意问题有了普遍意识。但是大多数科学家没有意识到相当数量的抗体存在非特异性结合 。令人不安的是。单克隆抗体的非特异性结合因抗体的不同而异。其结果影响了患者的诊断分级和治疗。抗体的非特异性结合可能是由于对相似表位的识别交叉反应产生的。它也有可能是筛选的杂交瘤额外链与目标抗体的共表达产生的。杂交瘤在体外产生。染色体呈四倍体。为恶性瘤衍生的人工细胞。杂交瘤细胞中染色体数目。融合亲本。都具有多样性。在某些生长条件下。单个杂交瘤包含多达50条染色体。早期融合亲本分泌额外的轻链。来自于亲本MOPC21 克隆。大多数都已淘汰。未淘汰的是一个经常转录的非生产性(异常)k链。这使的抗体基因克隆工作更加复杂化。尽管有报称杂交瘤中存在额外抗体链mRNA的积累。但它们在多大程度上有表达仍然不清楚。因为在分泌过程中重链和轻链的结合在很大程度上是随机的。一条额外的轻链将产生3种不同的IgG类型（如图1A）。而两条重链。两条轻链的组合产物多达10种IgG类型。产生4种结合不同表位的抗体（如图1B）。

图1. 附加链产生额外的重链轻链组合抗体形式

杂交瘤可能表达一种以上HC或LC的原因是多方面的(如图2),它有可能包含了其它混合克隆细胞。即杂交瘤不纯。其次是一个骨髓瘤细胞与多个脾细胞融合。或者一个脾细胞完成了两次有效重排。融合后重排和突变。特别是体外的长期培养。以及种种原因的组合。这种附加链的问题将会给研究以及诊断带来许多麻烦。尤其当假定单克隆抗体是一个确定的单一特异性分子实体时。

本文首次对以上问题进行探讨。紧随的是提议改善研究抗体的质量。建议用以验证过序列的重组表达抗体来解决杂交瘤单抗带来的困惑。

图2. 附加链的几种不同来源

结果

相当一部分杂交瘤存在额外链

杂交瘤中非目标轻链的异常表达已有报道。有不少文献报道了杂交瘤细胞中重链。轻链mRNA的多样性。这将给抗体基因克隆。重组表达带来很大麻烦。然而。很多研究只关注获得正确的特异性重组抗体。他们很少谈及这种额外存在的链这种普遍现象对单克隆抗体特异性和功能的影响。为了深入研究问题的严重性。我们从杂交瘤机构收集整合了一个数据集。数据集收集了来自于7个实验室过去20年的数据。对185个杂交瘤进行了分析。这些杂交瘤产生的抗体大多是商业化抗体。与先前研究关于额外抗体链报道不同的是。我们事先并没有刻意挑选那些基因难以克隆的杂交瘤。但通过测序人们通常可以实现重组抗体表达或者对抗体基因存取。我们的无偏向性的杂交瘤收集获取的样本是是多样的。但这些代表性的抗体通常是科研抗体。序列获得采用多种不同的标准方法。包括RACE,V区PCR测序。以及下一代测序NGS,在某些情况下。采取了消除已知非生产性异常轻链的工作。对185个杂交瘤进行了分析。确定了正确的VH/VL对。在这里。我们发现了126种杂交瘤。占比68.1%的杂交瘤包含1条生产重链和1条生产轻链基因。而59种杂交瘤。占比31.9%的杂交瘤包含不止1条生产重链和轻链。在含有额外链的抗体中。53种杂交瘤占比28.6%含有额外生产轻链。2种杂交瘤占比1.1%含有额外重链基因产物（如表1）。4种杂交瘤含有额外重链和额外轻链。预期将非特异性IgG混合物（如图1B）。

表1.杂交瘤通常含有附加重、轻链

从杂交瘤上清液中分离纯化的IgG。其特异性和亲和性均受到抗体链的影响

在上面描述的数据集中。开放阅读框的存在被用来识别抗体生产链。混合链的IgGs预计在两个方面影响抗体功能：（1）单位数量的抗体中含有有效结合靶点的抗体数目比预计要少。造成抗体表观结合较差；（2）存在不止一种抗原表位结合结构。造成额外的非特异型结合。从而影响了单克隆抗体的特异性。为了探讨这些影响的程度。采用酶联免疫吸附试验比较亲和纯化杂交瘤IgG与相应重组表达IgG的结合情况。杂交瘤随机选择子集的VH/VL组合（如表2）。在该数据集中测试的7个杂交瘤中。有6个包含额外的生产序列。在pol2ser5 这株杂交瘤中。表达量最高的HC/LC组合。重组recAb VH1/VL1 未能表现出特异性结合。而表大量较低的VL2与VH1表现出了特异性的结合。在另一杂交瘤SUZ12 中。IgG重链轻链配对产生的VH2/VL2即便是低浓度的抗原。也表现出极高的非特异性结合。Pol2杂交瘤。正确配对的VH和VL也表现出了多结合性。有趣的是。7种重组表达抗体表现出只有一种重链和一种轻链的抗体形式。与杂交瘤上清纯化抗体相比。重组抗体表现出了单位数量抗体更好的结合和特异性。

在第2组实验中。我们运用免疫组化的方法对随机挑选的6种杂交瘤以及重组表达抗体进行了比较。所有的杂交瘤上清以及重组表达抗体用proteinA或者proteinG亲和层析纯化。杂交瘤抗体以及重组抗体都做了相应的稀释。杂交瘤抗体表现出了较弱的阳性。

表2.杂交瘤以及不同轻重链配对重组抗体的结合反应

如图3。纯化的重组抗体比起杂交瘤抗体有更好的灵敏度（如图3A,3B）。更为有趣的是那些有着单一生产重链和轻链的重组抗体也有着比杂交瘤抗体更好的特性（如图3C）。与上述抗EED抗体的ELISA结果一致。到目前为止。在两种不同的杂交瘤实验中都观察到这种现象。其分子机制仍有待确定。除了提高了敏感性外。在杂交瘤中发现额外链的一些重组抗体(细胞角蛋白7,EpCAM)也表现出明显的非特异性结合。而在ß2 微球蛋白抗体。发现了额外的生产链。但是并没有表现出表观上的非特异性结合。额外的生产性V区转录本mRNA水平与非特异性结合并无明显联系。其中一些发生在总抗体转录本的0.1%以下。以及非特异性结合的程度。反映出无法预测任何单个组织或样本的额外链组合产生的非特异性结合。

图3. 重组抗体与杂交瘤抗体免疫组化实验中表现出更好的特异性和更高的灵敏度

讨论

额外序列有不同的起源

本文通过对185个杂交瘤克隆中。我们能够发现所有以前报道过的遗传变化和畸变。包括来自不同V区的生产性和非生产性HC和/或LCs。可能的重组中间体。小的插入缺失。移码突变。点突变及异常轻链。以及它们的组合。这些附加链的许多不同的潜在起源如图2所示。值得注意的是。许多额外的序列不能归因于融合亲本。对过去20年185种杂交瘤的分析。近一半有附加mRNA,三分之一有附加性生产链。大鼠杂交瘤显示出更高的额外的生产链发生率。大鼠(78.3%;29/37)比小鼠杂交瘤(19.9%;29/146)。6个具有额外生产能力重链的杂交瘤中有5个是小鼠来源。两种测序方法都鉴定出杂交瘤具有相似的额外生产链部分:NGS测序发现。136个分析克隆中45个(33.1%)表达了至少一条额外的生产链。而PCR克隆鉴定出49个分析克隆中的14个(28.5%)表达了至少一条额外的生产链。除了来自骨髓瘤融合亲本的预期异常的LC和V区。来自完全不相关的V基因的序列中编码轻链和重链mRNA并不罕见。这些序列有可能来自于骨髓瘤亲本融合了多个脾细胞。或者脾细胞发生了等位排除染色体的基因重排。所谓的“等位包容”。在人类B细胞中发生率仅有0.4%。也有可能。不用于产生特定链的等位基因以某种方式被重新激活。杂交瘤细胞最初至少含有4个HC和8个LC等位基因。在B细胞发育过程中分子调控机制不可能与四倍体/非整倍体。癌细胞/B细胞融合紧密相关。B细胞在发育过程中可以执行其他的重组。而这些步骤通常都先于类别转换。一些组分在杂交瘤中可能被重新激活。通过观察大鼠和小鼠杂交瘤中自发的类转换可以清楚地证明这一点。一开始科学家们就意识到这一点。努力的减轻它。额外链的编码问题来自于融合亲本。Kohler and Milstein 起初公开的细胞系为P3/X63Ag8 。这一细胞系分泌骨髓瘤P3蛋白。属于IgG1κ轻链。随后用NS1(免疫球蛋白非分泌克隆1号),抗体HC丢失细胞株。NS0(LC自发丢失的NS1变体)这些衍生细胞株。NS0表达了一种具有移码突变特征的LC mRNA。与其他细胞一样都是由MOPC21 派生而来。类似的。Sp/20由不分泌免疫球蛋白的SRBC抗体SP2克隆衍生而来。用K ohler and Milstein术语来讲。sP2本身产生四条链命名为HLGK(H和L来自于脾细胞。G和K来自于骨髓瘤细胞)。通过亚克隆和筛选。逐渐得到了HLK,HL,L,并最终得到了不表达任何链的Sp/20。第三链丢失的细胞系叫做P3/X63Ag8.653。直接来自于细胞系P3/X63Ag8 。融合亲本的V区都可以在
Imgt.org/IMGTeducation/IMGTlexique/U/Unproductivetranscript.html 查到。

功能抗体编码基因的确认

鉴别抗体轻重链是否正确组合最好的方法就是和杂交瘤抗体一起比较重组抗体对同一抗原的结合力。重组抗体的功能结合试验应与杂交瘤上清获得的IgG具有相同或更好的亲和力和特异性。特别是在检测到额外的VH/VL cDNAs时。所有通过NGS或者PCR不同引物扩增获得的产物获得的所有可以配对的VL和VH都需要逐个配对。逐一验证。目前瞬转常用HEK293系统。小规模表达可以获得足够的测试样品。测试需要做好特异性对照。因为有些轻链和同一重链配对产生相同的亲和力抗体。但是特异性却与最佳配对不同。例如表2中列举的pol2ser5 。在这些ELISA实验中。我们将单克隆抗体与重组抗体进行了比较。由于单克隆抗体很少用抗原亲和层析纯化(到目前为止。这一过程被认为是不必要的)。额外的没有靶结合活性的IgG(图1)将污染所有表达额外生产链的杂交瘤的IgG片段。我们在实验过程中是以总蛋白IgG浓度为起始做相应的稀释。这就导致了每个纯化的总IgG蛋白信号（我们通常认为IgG的反应信号就是我们目标抗体与抗原反应的信号）更低。这一效果在本研究中测试的克隆中非常明显。其次。额外的未鉴定的特异性运用于实验设计和检测都会产生意料之外的不确定性。附加链的存在可能导致非特异性结合。但情况并非总是如此。因为附加链识别的表位需要存在于特定的样本中。并且可能受到制备、固定或孵育条件的影响。

识别重链和轻链的正确序列组合的另一种方法是制备小的噬菌体展示库。通过抗原结合可以从中选择功能正确的配对链。但是这一方法需要警惕的是。与人类序列不同。一些啮齿类动物抗体通过E. coli 表达的scfv或Fab都是无效的。

综上所述。尽管杂交瘤产生的抗体DNA可能存在显著的内在多样性。但能够明确识别正确序列的方法是可靠的、可用的和经过充分证明的。考虑到重组抗体在灵敏度和特异性方面的提升。以及重组抗体的重现性。长期稳定的转染表达。因此。使用重组表达抗体无论在科研以及诊断方面都显得非常重要。

原文来源：

Bradbury ARM, Trinklein ND, Thie H,et,al.When monoclonal antibodies are not monospecific: Hybridomas frequently express additional functional variable regions.MAbs. 2018 May/Jun;10(4):539-546.

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